2 實(shí)驗(yàn)方法

 

 2．1 對(duì)照品溶液的配制 分別精密稱(chēng)取銀杏內(nèi)酯 A，B，c和白果內(nèi)酯對(duì)照品(干燥至恒重)適量，加甲 醇配成濃度各為1 rng／ml的對(duì)照品溶液。

 

 2．2 樣品溶液的制備 取一根20mm×360mm 的 玻璃柱，稱(chēng)取經(jīng)400℃ 下活化5h的酸性氧化鋁適 量，按濕法裝柱，稱(chēng)取銀杏葉粗提物0 5g，用1Oml 甲醇溶解，上柱，用60ml甲醇洗脫，洗脫液揮發(fā)至 干。配制氯仿 甲醇一水(4：3：2)的兩相系統(tǒng)，上下兩 相各取0 25ml，用此溶劑溶解經(jīng)柱層析后的揮干 物，配制成濃度約為lg／ml的樣品液(以粗提物計(jì))。

 

 2．3 薄層層析條件以銀杏內(nèi)酯A，B，c和白果內(nèi) 酯對(duì)照品溶液為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，取4％醋酸鈉改性的硅 膠H 薄層板，以甲苯一乙酸乙酯一丙酮一甲醇(4：6： 2 7 0．8)為展開(kāi)劑，上行展開(kāi)local，晾干，以醋酐熏 20min，160℃下烘30min，然后在紫外燈( =365nm) 下觀察熒光，各內(nèi)酯斑點(diǎn)呈不同程度的亮黃色。

 

 2 4 高速逆流色譜條件 采用氯仿一甲醇．水(4：3： 2)的溶劑系統(tǒng)，待兩相溶劑充分混合后，臨用前將其 分開(kāi)，在室溫下，下相作流動(dòng)相，上相作固定相，采用 2．0 ml／min的流速，由首端向尾端洗脫，主機(jī)正轉(zhuǎn)， 轉(zhuǎn)速為800r／min，固定相保留值為78％，進(jìn)樣2．0 ml，定時(shí)收集餾分，用TLC鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，用氮 氣將固定相由首端向尾端推出，并依次用乙醇 30ml，水40ml沖洗.

 

 結(jié) 果

 

 1 分離結(jié)果分析

 

 由于銀杏萜類(lèi)內(nèi)酯的紫外吸收較弱+因此在色 譜圖上未見(jiàn)有明顯的吸收峰，我們采用TLC的方法 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。從進(jìn)樣后25rain開(kāi)始，每隔 5rain收集餾分，經(jīng)濃縮后與銀杏萜類(lèi)內(nèi)酯對(duì)照品分 別點(diǎn)樣于薄層板上，按薄層層析條件展開(kāi)、顯色，發(fā) 現(xiàn)50rain以后收集的餾分出現(xiàn)銀杏萜類(lèi)內(nèi)酯。因 此，從進(jìn)樣后50rain開(kāi)始，每隔4min收集餾分，依次 記為1，2，??共18份(運(yùn)行120min)，將收集的餾 分濃縮后點(diǎn)樣于薄層板上，經(jīng)展開(kāi)、顯色，與對(duì)照品 比較，結(jié)果見(jiàn)圖l。從圖1可見(jiàn)：86～90，90～94min (第10，11號(hào)斑點(diǎn))，2個(gè)餾分只顯1個(gè)斑點(diǎn)，其Rf 值與白果內(nèi)酯(BB)一致；50～66min(第1～4號(hào)斑 點(diǎn))收集的餾份存在2個(gè)斑點(diǎn)，其Rf值與銀杏內(nèi)酯 A(GA)，銀杏內(nèi)酯B(GB)相似；66～86 min收集的 餾分，與BB，銀杏內(nèi)酯c(GC)的Rf值對(duì)應(yīng)位置有 較弱的熒光斑點(diǎn)，且同時(shí)存在其他雜質(zhì)；94min以后收集的餾分(第12～18斑點(diǎn))呈復(fù)雜的混合斑點(diǎn)，Rf 值偏小。

 

 2 分離鑒定

 

 經(jīng)TLC鑒定餾出物，我們專(zhuān)門(mén)收集86～94min 的餾分，并經(jīng)多次進(jìn)樣，合并餾出物，揮干，對(duì)餾出物 進(jìn)行MS，IR光譜分析，MS：m／z：327(M)，270(M一 56)，196(M一129)，178，129，57(基峰)，44；IR一 (cm )：3450(羥基)，1800，1780，1760(r_內(nèi)酯)。 并經(jīng)液相色譜分析，為單一峰，經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì) 照確認(rèn)為白果內(nèi)酯。

 

 討 論

 

 1 薄層層析展開(kāi)劑的選擇

 

 按文獻(xiàn)報(bào)道_] 的展開(kāi)系統(tǒng)，分別進(jìn)行考察后 發(fā)現(xiàn)，其分離效果不令人滿意，我們對(duì)此作了改進(jìn)。 采用甲苯一乙酸乙酯一丙酮一甲醇(6：4：2 7：0．8)為展 開(kāi)劑，其溶劑強(qiáng)度為3．99，分離效果好，斑點(diǎn)清晰集 中，其Rf值GC，GB，GA，BB分別為0 28，0 46， 0．54，0．65。

 

 2 溶劑系統(tǒng)的選擇

 

 2 1 溶劑配比、分層時(shí)間及兩相比的測(cè)定分別按 不同的配比配制3種溶劑系統(tǒng)，在容積為lOml刻度 試管中劇烈振蕩1min，使溶液充分混合，然后立即 垂直靜置，記錄溶劑從靜置到分為澄清兩層的時(shí)間， 同時(shí)記錄上下兩相的比值，結(jié)果見(jiàn)表1。

 

 

 

 2．2 分配比的測(cè)定 用60ml的分液漏斗，將上述3種溶劑系統(tǒng)配制20～30ml，分別取上下相各2ml然后再將對(duì)應(yīng)的兩相等體積混合于10ml試管中，分別加人約0 lg的銀杏葉粗提物 充分振蕩，使樣品在兩相中*溶解，然后分別取3個(gè)體系中上下相的粗提物溶液點(diǎn)樣于TLC板上，按TLC條件展開(kāi)觀察，我們估算出銀杏葉萜類(lèi)內(nèi)酯在氯仿．甲醇水(4：3：2)體系中的分配比zui接近1，其次為氯仿一正丙醇．甲醇一水(9：1：10 5：8)體系；在四氯化碳一甲醇．水(5：4：1)體系中，下相基本沒(méi)有銀杏葉萜類(lèi)內(nèi)酯存在。

 

 在用HSCCC進(jìn)行分離時(shí)，溶劑系統(tǒng)要求分層速度快，兩相體積大體相等，分配比一般選擇0.3

 

 3 操作參數(shù)的考察

 

 對(duì)確定的溶劑系統(tǒng)分別采用兩種條件作考察，由首端向尾端洗脫．主機(jī)正轉(zhuǎn)作為溶劑系統(tǒng)的上機(jī)操作條件，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)速恒定的條件下，以下相作流動(dòng)相，上相作固定相時(shí)其保留值可達(dá)78％。同時(shí)發(fā)現(xiàn)增大轉(zhuǎn)速或減步流速，都可以降低或消除固定相的帶出現(xiàn)象；但流速過(guò)低時(shí)，分離時(shí)間延長(zhǎng)，分離效率降低；而長(zhǎng)期高速旋轉(zhuǎn)，產(chǎn)生的熱量將影響分離的穩(wěn)定性。

 

 4 樣品的制備對(duì)分離的影響

 

 由于樣品不能單獨(dú)溶于上相或下相，而采用等體積的上下兩相配制樣品溶液，可*溶解樣品，因此我們采用等體積的上下兩相混合液溶解樣品。

 

 5 檢測(cè)手段

 

 銀杏萜類(lèi)內(nèi)酯的檢測(cè)方法多采用示差折光檢測(cè)器、蒸發(fā)激光散射檢測(cè)器，由于儀器設(shè)備要求高，因此很難推廣。我們采用TLC為檢測(cè)手段，對(duì)餾分進(jìn)行定性分析，能較準(zhǔn)確反映餾分的組成，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析鑒別，在此條件下，準(zhǔn)確分離制得雎單體。